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SDx系膜系统

固定膜结构

固定膜是以亲水性的聚乙二醇(PEG)链通过有机二硫化物固定剂以共价键结合到金电极表面的保持平坦的支撑磷脂双分子层。亲脂烷烃植烷基团键合到聚乙二醇链的顶部充当支架围绕该膜脂质自发聚集,最终形成连续膜。

二硫化物固定剂,PEG链,和植烷基团组成一个分子束,因为它将膜束缚在了金表面。事实上,这些分子束在金基片上以相似分子的形式彼此分离的,称为spacer,因为它们缺乏亲脂的植烷基团。这些spacer在固定膜下,并且与膜没有任何的直接接触。分子束和spacer完全覆盖金表面,但它们不是紧密堆积的,因为它们是由大量的有机二硫化物固定基团分隔的。

                                  图1 组件的系膜系统

分子束和spacer之间的平均距离约含9个水分子,而金表面上方膜的的高度为约4 nm(但0.5 nm是被有机二硫化物固定剂占用)。

因而膜与金表面之间的空间是PEG链,二硫化物固定剂固基团,水分子,各种阳离子和阴离子,以及小的水溶性分子的混合物,被统称为tethaPlasm™。它类似于一个活细胞的细胞质。一个恒定的偏置电压可以给含有过量阳离子或阴离子的tethaPlasm'的'充电,在tethaPatch或tehaPod实验(见下文)之前。

固定膜很难!

分子束对spacer的比例是可以在制造过程中改变的。标准tethaPlate™通常采用1:10的比例,这是兼顾细胞膜的稳定性和灵活性的最佳比例。如果需要更大的灵活性,小至1:100的比例也可以用,但不推荐低于这个比例,因为膜的完整性会变得不可靠。相反,如果需要特殊的稳定性,可使用高达100%的比例。

用标准10%制备的固定膜非常强健,具有几个月的典型寿命(如果实验之间储存在4℃的话)。它们还非常耐电脉冲,并且适用范围在-500到+800 mV,这远远大于可在传统的全细胞电压钳位实验中施加的电位。

The tethaPlate

tethaPlate™ 包括六个各有一个金电极的腔室(表面积2.1 mm2,3.0×0.7 mm),金电极上已预先涂有分子束和间隔分子。另外自发形成膜只需要一个合适的磷脂混合物。另一个无涂层的金电极立在0.15毫米膜上面,但不与膜进行相互作用。

tethaPlate已被证明是一个盛放固定膜制剂非常坚固的外壳,保存在4℃时可稳定几个月,而许多离子通道的准备工作将持续数天,几个星期(或更多)!

在培训视频上看看如何组装一个tethaPlate并制作固定膜。

膜蛋白

许多蛋白质包括亲脂性和亲水性部分,这些影响蛋白质的三级结构。亲脂部分通常是与细胞或细胞器,膜相关联的,因此蛋白质被称为膜蛋白。

有一类特殊的膜蛋白是促进阳离子或阴离子穿过不透水亲脂性细胞膜。这种蛋白质被称为离子通道。

           图2 离子通道蛋白在固定膜上显示的规模。
           注意蛋白质的方向,使其“上层结构”封装在tethaPlasm外面。

固定膜的分子束/间隔比决定了可容纳的蛋白质的最大尺寸。人们发现标准1:10的比例适于宿主的蛋白质结构高达40000 Da(即实际在膜当中的蛋白的部分),然后将这些单独的蛋白可以组装进入低聚体的孔隙结构 - 这通常是固定膜中离子通道的最终形式。

注意,即使是小的离子通道多肽,如短杆菌肽(1882 Da)和缬氨霉素(1111 Da),也同样可以容纳在固定膜中。

较大的离子通道,如在图2中所示,经常有“上层结构”延伸到邻近于所述膜的水溶液中。即使拥挤的tethaPlasm也不能不能容纳一个中等大小的上层建筑,迫使膜蛋白采取一种较优的方向(像经常发生在一个活细胞内的情况一样)。

离子通道

低分子量多肽离子载体和离子通道(如短杆菌肽、霉素、爪蟾抗菌肽、丙甲菌素和离子霉素)有市售的纯物质。较大的蛋白可以由市售的洗涤剂或脂质基质提供。然而,大多数较大的蛋白必须利用基因组技术使用特定的细菌培养制成,无论是由自己还是由合作的生物技术公司获得。

通常情况下,培养细菌要有相应的基因或RNA片段人为地植入,使它们表达所需的离子通道蛋白。通过几天的培养后可以获得细菌,对蛋白质组分分离和纯化(通常通过凝胶电泳)。

而这是在 1990 年时最先进的技术,现在这些技术得到了很好的发展并在蛋白质组学实验室广泛使用。

人类基因组本身被认为为大约400个不同类型的离子通道代码,且只有一小部分被详细研究。然而,只有少数离子——钠、钾、钙、镁、氢、氯(和其他阴离子)——相关离子通道的研究。不同组织不同类型的活动需要多种离子通道。例如不同的钾离子通道可以参与神经细胞的动作电位传播,心率的调节,细胞对压力变化的响应(机械敏感性离子通道)。

不同的生物体有类似的离子通道, 但是根据物种要求不同结构往往稍微改变以优化功能。

离子载体

天然的(如离子霉素和calicimycin),以及人工的(如冠醚,calixeranes和穴状配体)离子载体也可以用系膜系统研究。离子载体并不总是多肽,也可能是相当小的分子,但是它们必须是至少部分亲脂性,以确保它们能够进入膜。

经典的膜片钳

经典的膜片钳实验中使用一个微量电极,其定位对细胞膜只覆盖一个,或是几个离子通道。通常电极要获得合适的位置,需要长期的反复实验过程。离子电流信号通常非常小(几皮安),必须非常小心的操作以实现良好的信号/噪声水平。

                          

         图3 一个经典的膜片钳实验(http://en.wikipedia.org/wiki/Patch_clamp)

该技术的变体包括全细胞和卵母细胞的膜片钳,其中许多离子通道的信号可以同时记录。这提供了更大的(和更安静的)信号,但可能会比较复杂,因为可能存在几种类型的离子通道并发信号的情况。

近年来全自动膜片钳已进入市场,但是由于为了获得可再现的信号,定位微量电极困难,该技术仍然受到阻碍。

基因组学和蛋白质组学革命

正如上面提到的,21世纪的最初几年,我们看到基因组学和蛋白质组学技术快速发展,现在可以隔离大量的单一类型的离子通道蛋白。这种技术现在在大学、研究机构、制药企业实验室和医院研究部门广泛应用。

首次,在常规的基础上用适量的纯蛋白提供单一类型的离子通道的研究可以完成。研究人员不再局限于为检测一个或几个离子通道做补充。

The tethaPatch

在人工固定膜的一个大膜片 (面积2.1平方毫米)里组装一个单一类型的离子通道蛋白,介于1和1000万个通道可以并行进行研究。测量的离子电流是来自在膜片上所有离子通道的总和,所以可以获得微安范围信号和同时得到低噪声水平。因为离子通道自发地将自己容纳到工作电极键合的膜上,不同于微量电极的方法。

tethaPatch™ 技术,类似于全细胞膜片钳,通常在几分钟内提供结果,否则与常规技术则需要数小时。也因为固定膜非常强劲, 可以应用电压脉冲,否则会“打击”传统的密封膜片箝制备。因而,与先前可实现的脉冲振幅(通常小于±300毫伏以下)相比,电压门控,以及机械敏感性离子通道,现在可以在更宽范围的脉冲振幅(-500至800毫伏之间的电位可以应用)下研究,从而导致新的离子通道行为的机制的解成。

ER466 集成稳压器适合与tethaPatch一起使用,用于脉冲产生和电流信号的数据采集。

The tethaPod

tethaPod 技术利用系膜系统提供的相对较大的信号。通过给tethaPlate™电极施加一个小振幅(20 mV) 频率变化的交流信号,膜电导率和电容可以直接测定。这特别适用于制药研究,将不同浓度的离子通道阻断剂或激励剂加到tethaPlate™可以连续监测膜电导。采用剂量/响应方法分析结果,可快速筛选潜在的候选药物。

引文

Comparative Study of the Bacterial Sodium Channel NaChBac Function using Patch Clamp and A.C. Impedance Spectroscopy in a Tethered Membrane.
Bruce A. Cornell, Gwenael Scolan, Andrew M. Powl, Sonia Carne, Bonnie A. Wallace, Biophysical Journal, 102, 3, 338a, 2012. DOI: 10.1016/j.bpj.2011.11.1852

The protective effect of osmoprotectant TMAO on bacterial mechanosensitive channels of small conductance MscS/MscK under high hydrostatic pressure. 
Evgeny Petrov, Paul R. Rohde, Bruce Cornell, and Boris Martinac. Channels, 6:4, 1-10, 2012. DOI: 10.4161/chan.20833

Ion Channel Proteins that Spontaneously Insert into Lipid Bilayer Membranes: An Impedance Spectroscopy Study Employing Tethered Membranes.
Bruce A. Cornell, Heba Alkhamici, Louise Brown, Sonia Carne, Sophia C. Goodchild, Russell Richards, and Stella M. Valenzuela. Biophysical Journal, 102, 682a-683a, 2012. DOI: 10.1016/j.bpj.2011.11.3710

A High-Throughput Technique for Screening Novel Antibacterial Agents Targeting Bacterial Mechanosensitive Channels.
Bruce A. Cornell, Andrew R. Battle, Sonia Carne, and Boris Martinac. Biophysical Journal, 102,122a,  
DOI: 10.1016/j.bpj.2011.11.683

Making lipid membranes even tougher.
Jognandan Prashar, Phillip Sharp, Mathew Scarffe, and Bruce Cornell. Journal of Materials Research, 22, 2189-2194, 2007. DOI: 10.1557/jmr.2007.0288

Tethered Bilayer Membranes Containing Ionic Reservoirs:  Selectivity and Conductance.
Gowri Krishna, Jurgen Schulte, Bruce A. Cornell, Ron J. Pace, and Peter D. Osman. Langmuir, 19, 2294–2305, 2003.
DOI: 10.1021/la026238d

Tethered Bilayer Membranes Containing Ionic Reservoirs:  The Interfacial Capacitance.
Gowri Krishna, Jurgen Schulte, Bruce A. Cornell, Ron Pace, Lech Wieczorek, and Peter D. Osman. Langmuir, 17, 4858–4866, 2001. DOI: 10.1021/la001480a

Tethered-bilayer lipid membranes as a support for membrane-active peptides.
B. A. Cornell, G. Krishna, P. D. Osman, R. D. Pace and L. Wieczorek. Biochemical Society Transactions, 29, 613–617,  2001. DOI: 10.1042/bst0290613

Tethered Lipid Bilayer Membranes: Formation and Ionic Reservoir Characterization.
Burkhard Raguse, Vijoleta Braach-Maksvytis, Bruce A. Cornell, Lionel G. King, Peter D. J. Osman, Ron J. Pace, and Lech Wieczorek. Langmuir, 1998, 14, 648–659 1998. DOI: 10.1021/la9711239

 

 Trademarks: tethaPod, tethaPatch, tethaPlate, and tethaPlasm are trademarks of SDx Tethered Membranes Pty Ltd.

 

 

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